大黄鱼Larimichthys crocea属硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科，曾为我国东海、黄海及南海一带的重要经济鱼类。因过度捕捞，曾一度濒临灭绝。自20世纪80年代后期，随着繁育和养殖技术的突破，大黄鱼的养殖在浙江、福建、广东、江苏等沿海省份相继推开。历经30余年的发展，大黄鱼的年养殖产量已超20万吨，位居我国养殖海水鱼首位（图1）。
图1 我国2019年主要养殖海水鱼产量（数据来源：《2020中国渔业统计年鉴》）
近年来，大黄鱼 “内脏白点病”频频发生，严重困扰了养殖业的可持续发展。大黄鱼内脏白点病是一种由杀香鱼假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida引起的严重传染性疾病，发病死亡率可高达70~80%，典型病征表现为肝、脾及肾出现大量的白色肉芽肿（图2）。因此，确定大黄鱼内脏白点病病原的致病机制，并由此研发相关的病害防控疫苗成为大黄鱼健康养殖的关键科学问题和重要技术路径。浙江海洋大学陶震博士近期在此领域取得了重要进展。
图2 “内脏白点病”的典型病症（肝脾肾均可出现白色结节，图示脾脏白色结节）
一、 确定了大黄鱼内脏白点病病原菌杀香鱼假单胞菌的致病性主要来自于一套细菌VI型分泌系统（T6SS-1）
利用分泌蛋白质组学分析实验，陶震博士发现大黄鱼内脏白点病病原菌杀香鱼假单胞菌的基因组中至少携带着两套具有功能的细菌VI型分泌系统（T6SS），而且它们的活性与大黄鱼感染率呈现高度正相关（图3），由此提出了T6SS的功能活性与细菌致病密切相关的科学假设。
图3 比较分泌蛋白质组学发现杀香鱼假单胞菌含有两套具有功能的T6SS
为了验证这一假设，对杀香鱼假单胞菌T6SS进行了系统的毒力验证工作。通过基因组测序及生物信息学分析发现了3套T6SS编码序列，分别命名为（PP T6SS-1、2、3）。然后，利用基因敲除构建了一系列T6SS突变株，并结合大黄鱼人工感染实验，证明T6SS-1是决定杀香鱼假单胞菌致病性的关键毒力因子（图4）。同时，通过对 T6SS保守基因进行的系统进化关系分析，发现杀香鱼假单胞菌基因组中的T6SS-1极有可能来自于较近期（相对于T6SS-2和-3）的一次基因水平转移，获得T6SS-1是杀香鱼假单胞菌进化成为鱼类病原菌过程中的关键一步（图5）。
图4 （A）大黄鱼经腹腔注射ΔT6SS-1、ΔT6SS-2、ΔT6SS-3及野生型杀香鱼假单胞菌6 d后的症状；（B）注射10 d的大黄鱼死亡情况；ΔT6SS-1突变株的毒力显著下降。
图5 利用最大拟然法（Maximum likelihood）构建的系统进化树
（最大拟然法构建的系统进化树分析显示杀香鱼假单胞菌基因组中编码了3套T6SS，它们具有不同的进化来源：其中T6SS-2和T6SS-3与其他假单胞菌中携带的T6SS形成聚类，而T6SS-1与非假单菌属中携带的T6SS的亲缘关系更近，表明T6SS-1可能来自于近期横向基因转移事件）
二、 首次开展了细菌VI型分泌系统（T6SS-1）功能缺陷型候选减毒疫苗株的免疫接种实验并证实其有效性
在上述关键致病因子分析的基础上，构思了制备大黄鱼内脏白点病减毒活疫苗的可能技术路径：从杀香鱼假单胞菌基因组中去除T6SS-1相关的核心基因，构建定向减毒的候选疫苗株。构建了1.0版本的大黄鱼内脏白点病候选减毒疫苗株（ΔtssD-1），并进行了免疫实验验证：在大黄鱼中，采用腹腔注射的方式进行接种免疫实验，发现该候选疫苗能有效地诱导鱼体产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答，实验周期内相对免疫保护率为86.3%，说明该候选疫苗能提供理想的免疫保护；团队还采用同样的注射手段，验证了该候选疫苗的动物安全性（图6）。
图6 腹腔注射免疫试验证明T6SS-1功能缺陷株ΔtssD-1能诱导大黄鱼机体产生理想的特异性免疫保护力
综上所述，浙江海洋大学水产学院陶震博士所在团队对大黄鱼内脏白点病病原杀香鱼假单胞菌的关键毒力因子进行了深入的挖掘和鉴定，利用基因敲除技术对致病株进行定向减毒，成功构建了安全的减毒活疫苗候选株。结果表明该减毒疫苗能有效地诱导大黄鱼产生抗杀香鱼假单胞菌感染的免疫保护。该候选疫苗有望能为产业应对内脏白点病问题提供一种绿色高效的解决方案。该项研究的主要成果已在《Aquaculture》和《FEMS microbiology letters》等国际期刊发表高质量论文并申请发明专利。未来，团队还计划和相关疫苗企业合作，进一步开发适合浸泡或口服免疫的疫苗，从而更好地将研究成果带向产业应用，真正地解决大黄鱼养殖生产病害防控的产业瓶颈问题。关于杀香鱼假单胞菌可能存在的温度依赖型大黄鱼致病机制及细菌在海域环境的周年生活史还有待进一步深入研究，该研究对浙江海洋大学正在开展的野生大黄鱼资源重建研究具有重要的支撑作用。
主要论文及链接：
论文一Zhen Tao, Tao Zhou, Suming Zhou, Guoliang Wang, 2016. Temperature-regulated expression of type VI secretion systems in fish pathogen Pseudomonas plecoglossicida revealed by comparative secretome analysis. FEMS Microbiology Letters, Volume 363, Issue 22, November 2016.
论文连接：https://academic.oup.com/femsle/article/363/22/fnw261/2691304
论文二 Zhen Tao, Yue Xu, Suming Zhou, Dong Qian, Minhai Liu, Weiye Li, Wenjun Xu, Xiaojun Yan, 2020. Acquisition of a type VI secretion system is critical for Pseudomonas plecoglossicida induced granulomas in fish internal organs. Aquaculture. Volume 516, 1 February 2020, 734629.
论文连接：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044848619311846
论文三 Haoda Ye, Zhijin Xu, Zhen Tao, Weiye Li, Yanyan Li, Amin Yang, Wei Wang, Xiaolong Yin, Xiaojun Yan, 2020. Efficacy and safety of Pseudomonas plecoglossicida mutant ΔtssD-1 as a live attenuated vaccine for the large yellow croaker (Larimichthys crocea). Aquaculture, Volume 531, 30 January 2021, 735976.
论文链接：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S004484862032319X
